Prüfung steriler Produkte

Artikel Artikelnr.
Prüfung auf Sterilität mit Membranfiltration (MCE-Membran) 7130015
Prüfung auf Sterilität mit Membranfiltration (PDF-Membran) 7130016
Prüfung auf Sterilität mit Direktbeschickung 7130005
Validierung Steriltest pro Testkeim (6 Keime sind notwendig) 7130020

Diese Prüfung wird bei wässrigen, sterilen Lösungen (Parenteralia, Extraktions- oder Spüllösungen sowie sonstige sterile Lösungen), wasserlöslichen Feststoffen, öligen Flüssigkeiten sowie Salben und Cremes durchgeführt. Eine Prüfung auf Sterilität wird durchgeführt, um zu zeigen, dass die untersuchten Produkte frei von mikrobiologischer Kontamination sind.

Da eine Prüfung auf Sterilität eine zerstörende Prüfung ist, können nur Stichproben einer Sterilisationscharge untersucht werden. Proben, Umfang und Menge sind in der jeweiligen Pharmakopöe festgelegt (z.B. Ph. Eur.: Tab. 2.6.1-2: Mindestprobenmengen für jedes Nährmedium und Tab. 2.6.1-3: Mindestanzahl zu prüfender Einheit)

Die Aussagekraft eines Steriltests im Hinblick auf die Sterilität der gesamten Sterilisationscharge ist daher eingeschränkt. Sie ist umso größer, je mehr zusätzliche Parameter eingehalten bzw. überprüft werden, wie:

  • die Sterilisation erfolgt nach einem validierten Verfahren
  • eine adäquate Menge von Bioindikatoren, für die eine Reduktion um 106 Keime nachgewiesen werden kann, wird in jeder Sterilisationscharge sinnvoll verteilt
  • es besteht ein effizientes Probeentnahmeverfahren

PIC/S: Guide to good manufacturing practice for medicinal products Annex 1

USP: United States Pharmacopeia <71> Sterility (aktuelle gültige Version)

Ph. Eur: Europäische Pharmakopöe 2.6.1. Prüfung auf Sterilität (aktuelle gültige Version)

EudraLex:

  • The Rules Governing Medicinal Products in the European Union Volume 4
  • EU Guidelines to Good Manufacturing Practice
  • Medicinal Products for Human and Veterinary Use
  • Annex 1 Manufacture of Sterile Medicinal Products

Prüfung nicht steriler Produkte

Artikel Artikelnr.
Bestimmung der Keimbelastung 7140005
Bestimmung des Oberflächenkeimgehalts 7150025
Bestimmung auf ausreichende antimikrobielle Konservierung 7130018
Sporenstreifentest 7100011

Diese Prüfung wird zur Bestimmung der Keimbelastung (Zählung der Population lebensfähiger Mikroorganismen) auf oder in Produkten (insbesondere Medizinprodukte), Bauteilen, Rohstoffen oder Verpackungen durchgeführt.

Insbesondere die grundlegenden Arbeitstechniken der Ausplattierung und der Membranfiltration werden in den internen Prüfvorschriften beschrieben und erfüllen die Anforderungen der Pharmakopöen.

Unter dem Begriff "Keimbelastung" (Bioburden) versteht man die Gesamtzahl der lebensfähigen Mikroorganismen auf einem Material bzw. Produkt. Da es nicht möglich ist, die genaue Keimbelastung zu bestimmen, wird die Keimzahlbestimmung nach einem festgelegten Verfahren, die auf das jeweilige Produkt abgestimmt und validiert sind, durchgeführt.

Die Kenntnis der Keimbelastung ist wichtig im Hinblick auf:

  • die Routineüberwachung des Herstellungsprozesses für ein steriles Produkt
  • die Festlegung der Sterilisationsbedingungen
  • die Bewertung der Wirksamkeit von Reinigungsprozessen
  • die Überprüfung auf ausreichende Konservierung eines Produktes (s. Ph. Eur. 5.1.3.)
  •  die Überwachung der Qualität von Ausgangsstoffen und Fertigprodukten (s. Ph. Eur. 5.1.4.)
  • Prozessvalidierungen

Die Prüfung nicht steriler Produkte erfolgt nach folgenden Vorgaben:

  • DIN EN ISO 11737-1 10-2021: Sterilisation von Medizinprodukten - Mikrobiologische Verfahren-Teil 1: Bestimmung der Population von Mikroorganismen auf Produkten
  • Ph. Eur. 2.6.12: Mikrobiologische Prüfung nicht steriler Produkte: Zählung der gesamten vermehrungsfähigen Keime
  • Ph. Eur. 5.1.4: Mikrobiologische Qualität pharmazeutischer Zubereitungen
  • USP 61: Microbial limit tests

Weitere Prüfungen sind Stabilitätstest hinsichtlich der Konservierung gemäß den folgenden Vorgaben:

  • Ph. Eur. 5.1.3: Prüfung auf ausreichende Konservierung
  • USP 51: Antimicrobial Effectiveness Testing

Allgemein wird zur Wahl des geeigneten Verfahrens der Entscheidungsbaum (DIN EN ISO 11737-1 A.6.1.1 Anhang A und B ) herangezogen.

Für die Durchführung jedes dieser 4 Schritte gibt es verschiedene Methoden, die in der Vorschrift DIN EN ISO 11737-1 beschrieben werden. Die Methoden, die von der ACILA AG verwendet werden, sind leicht zu reproduzieren und wurden aufgrund von Erfahrungswerten festgelegt. Von den dort beschriebenen Methoden verwendet ACILA AG:

  • Schritt 1: eine Elutionsmethode bzw. Schütteln/Mischen bei Direktbeschickung. Methode abhängig vom Produkt (siehe Anlage 1)
  • Schritt 2: Standardmäßig werden 2 Methoden verwendet:
    • Membranfiltration mit anschließender Überführung der Filter auf geeignete Nährmedien, die ein Wachstum von aeroben und anaeroben Keimen, sowie Hefen und Schimmelpilzen ermöglichen.
    • Plattenausstrichverfahren die direkte Ausplatierung des Produkts, eines bereits aufgearbeiteten Produkts oder einer Elution auf geeignete Nährmedien, die ein Wachstum von aeroben und anaeroben Keimen, sowie Hefen und Schimmelpilzen ermöglichen.
  • Schritt 3: erfolgt mit dem Verfahren der Produktbeimpfung
  • Schritt 4: die Zählung der Koloniebildenden Einheiten (KBE)

Für die Validierung der Verfahren können ebenfalls verschiedene Methoden angewendet werden, die alle in der DIN EN ISO 11737-1 beschrieben sind. Von der ACILA AG wird die Validierung mit der Methode der Elution von Mikroorganismen durchgeführt, mit der eine bekannte Anzahl Keime nach der Produktkontamination, anschließend vom Produkt gelöst und wiedergefunden werden muss.

Zulässige Grenzwerte für die Ausgangskeimzahl von Medizinprodukten gibt es nicht. Sie sind im Laufe der Routinebestimmung, auf der Grundlage der erstellten Daten, festzulegen und zu dokumentieren. Im allgemeinen wird von einer Keimbelastung < 100 KBE/Gerät ausgegangen.


Prüfung auf Bakterien-Endotoxine

Folgende Methoden werden bei ACILA durchgeführt:

1. Ph. Eur.: 2.6.14 LAL-Test – Nachweis oder Bestimmung von Endotoxinen gramnegativer Bakterien mit Hilfe von Amöbozyten-Lysat vom Pfeilschwanzkrebs nach:

  • 1.1 Gelbildungsmethode
  • 1.2 Turbidimetrisch-kinetische Methode
  • 1.3 Turbidimetrisch-chromogene Methode

Normative Verweise:

Europäisches Arzneibuch (Ph. Eur.): 2.6.14 Prüfung auf Bakterien-Endotoxine

United States Pharmacopeia (USP):

  • <85> Bacterial Endotoxins
  • <1225> (Validation of Compendial Procedures)
  •  <1225> (Validation of Compendial Procedures)
  • <161> Transfusion and infusion assemblies and similar medical devices.

American National Standard:

ANSI/AAMI ST72:2019 (Bacterial endotoxins- test methods, routine monitoring and alternatives to batch testing)

1.1 Gelbildungsmethode:
Artikel Artikelnr.
Validierung Endotoxin-Bestimmung gemäß Methode A, Ph. Eur. & USP (Geltest) 7111017
Endotoxin-Bestimmung (quantitativ) gemäß Methode B, Ph. Eur. & USP (Geltest) 7112005
Endotoxin-Grenzwerttest gemäß Methode A, Ph. Eur. & USP (Geltest) 7113004
Endotoxin-Produktcharakterisierung gemäß Methode B, Ph. Eur. & USP (Geltest) 7112024

(Die Artikel-Nummern 7112005 & 7113004 sind für Testungen an Produkten bestimmt, deren Prüfverfahren vorher an drei Produktionschargen erfolgreich validiert wurden.)

Bei den Gelbildungsmethoden wird zwischen der Grenzwertprüfung (Methode A) sowie quantitativer Bestimmung (Methode B) unterschieden. Diese Methoden beruhen auf einer Reaktion des Amöbocytenlysates bei ca. 37 °C mit BakterienEndotoxinen, die mit einer Gelbildung einhergeht.


1.2 Turbidimetrisch-kinetische Methode:
Artikel Artikelnr.
Validierung Endotoxin-Bestimmung gemäß Methode C, Ph. Eur. & USP (kinet.-turbid.) 7111018
Endotoxin-Bestimmung (quantitativ) gemäß Methode C, Ph. Eur. & USP (kinet.-turbid.) 7112010
Endotoxin-Grenzwerttest gemäß Methode C, Ph. Eur. & USP (kinet.-turbid.) 7113005
Endotoxin-Produktcharakterisierung gemäß Methode C, Ph. Eur. & USP (kinet.-turbid.) 7112025

(Die Artikel-Nummern 7112010 & 7113005 sind für Testungen an Produkten bestimmt, deren Prüfverfahren vorher an drei Produktionschargen erfolgreich validiert wurden.)

Der Test beruht auf einer Reaktion des Amöbocytenlysates bei ca. 37 °C mit Bakterien-Endotoxinen, die mit einer Trübung einhergeht. Die Trübung wird photometrisch gemessen. Als Maß für den Endotoxingehalt einer Probe dient die Reaktionszeit (onset time), d.h. die Zeit, die verstreicht, bis ein gewünschter Schwellenwert erreicht ist. Es werden jeweils die Logarithmen zur Basis 10 der eingesetzten Standardkonzentrationen und der gemessenen Reaktionszeiten gegeneinander aufgetragen.

Durch die Punkte wird eine Ausgleichsgerade gezogen. Der Endotoxingehalt einer unbekannten Probe wird anhand dieser Standardgeraden berechnet.

Der Bereich der Standardgeraden umfasst im Allgemeinen Endotoxinkonzentrationen von 1 bis 0,001 I.E./ml. Messungen in diesem Bereich können ausgewertet werden. Das bedeutet, dass die untere Endotoxin-Nachweisgrenze in einer Prüflösung 0,001 I.E./ml beträgt.


1.3 Kinetisch-chromogen Methode:
Artikel Artikelnr.
Validierung Endotoxin-Bestimmung gemäß Methode D, Ph. Eur. & USP (chromogen-kinet.) 7111016
Endotoxin-Bestimmung (quantitativ) gemäß Methode D, Ph. Eur. & USP, (chromogen-kinet.) 7112015
Endotoxin-Grenzwerttest gemäß Methode D, Ph. Eur. & USP, (chromogen-kinet.) 7113006
Endotoxin-Produktcharakterisierung gemäß Methode D, Ph. Eur. & USP, (chromogen-kinet.) 7112026

Endotoxine katalysieren die Aktivierung eines Proenzyms im Limulus Amebocyte Lysate (LAL).

Die Aktivierung wird durch die Konzentration von Endotoxinen bestimmt. Das aktivierte Enzym katalysiert die Spaltung des pNitroanilin (pNA) aus dem farblosen Substrat (Ac-Ile-Glu-Ala-ArgpNA). Die Konzentration von Endotoxin in einer Probe während der Reaktionszeit wird im Vergleich zu der Reaktionszeit von Lösungen mit bekannten Mengen Endotoxinstandard berechnet (Standardkurve). Der Bereich der Standardkurve umfasst im Allgemeinen Endotoxinkonzentrationen von 0,001 bis 1,0 I.E./ml.


2. Ph. Eur.: 2.6.32 Prüfung auf Bakterien‐Endotoxine unter Verwendung des rekombinanten Faktors C (rFC):
Artikel Artikelnr.
Validierung Endotoxin-Bestimmung gemäß rFC-Methode, Ph. Eur. 7213001
Endotoxin-Bestimmung (quantitativ) gemäß rFC-Methode, Ph. Eur. 7213006
Endotoxin-Grenzwerttest gemäß rFC-Methode, Ph. Eur. 7213005
Endotoxin-Produktcharakterisierung gemäß rFC-Methode, Ph. Eur 7213015

Diese Prüfung basiert auf der Gensequenz des Pfeilschwanzkrebses. Hierbei kommt eine fluorimetrische Methode zum Einsatz.

Im Bereich der Bestimmung der Bakterien-Endotoxine wurde im Europäischen Arzneibuch die rFC-Methode als eigenes Kapitel (Ph. Eur. 2.6.32) implementiert. Sie bietet folgende Vorteile gegenüber dem LAL-Test:

  • keine falsch-positiven Ergebnisse durch Anwesenheit von β-Glucanen
  • höhere Sensitivität
  • ressourcenschonende und nachhaltige Alternativmethode

Der Messbereich umfasst im Allgemeinen Endotoxinkonzentrationen von 0,001 bis 1,0 I.E./ml.


Untersuchung von Wasser

ACILA führt im akkreditierten Bereich Reinheitsprüfungen an Wasser (WFI) durch.

Folgenden Methoden sind akkreditiert:

  1. Prüfungen gemäß Europäischem Arzneibuch (Ph. Eur.)
    • Prüfung steriler Produkte
    • Prüfung nicht steriler Produkte
    • Prüfung auf Bakterien-Endotoxine
    • Partikel Test
  2. Prüfungen gem. Normverfahren

DIN ISO 11737-1 10-2021: Sterilisation von Medizinprodukten - Mikrobiologische Verfahren-Teil 1: Bestimmung der Population von Mikroorganismen auf Produkten

DIN EN ISO 9308-1 2017-09: Wasserbeschaffenheit - Zählung von Escherichia coli und coliformen Bakterien - Teil 1: Membranfiltrationsverfahren für Wässer mit niedriger Begleitflora

DIN EN ISO 7899-2 2000-11: Wasserbeschaffenheit - Nachweis und Zählung von intestinalen Enterokokken - Teil 2: Verfahren durch Membranfiltration

DIN EN ISO 16266 2008-05: Wasserbeschaffenheit - Nachweis und Zählung von Pseudomonas aeruginosa - Membranfiltrationsverfahren

DIN EN ISO 6222 1999-07: Wasserbeschaffenheit - Quantitative Bestimmung der kultivierbaren Mikroorganismen - Bestimmung der Koloniezahl durch Einimpfen in ein Nähragarmedium

DIN EN ISO 11731 2019-03: Wasserbeschaffenheit - Zählung von Legionellen